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DAR值是ADC药物最重要的质量属性，因为其决定了可以输送到肿瘤的“有效载荷”，可以直接影响安全性和有效性。小编之前对DAR值的每个分析方法做了专题介绍，今天对ADC药物DAR值测定的方法进行汇总介绍，以期可以给大家带来帮助。一.紫外分光光度法（UV）紫外可见分光光度法是一种测定DAR值最简单方便的方法，通过测定ADC在不同波长下的吸收值、裸抗体和药物的消光系数，可以确定平均抗体偶联比。紫外/可见分光光度法用于定量分析的理论基础是比尔-朗伯定律，即吸光度与浓度成正比关系：

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A为吸光度，ε为消光系数（物理常数，与物质的氨基酸组成有一定关系），l为比色皿的路径长度（1cm,1mm）,c为浓度。当体系中有多种组分，且各组分有不同的吸收光谱，各自无干扰，则各组分吸光度可以加和。即：

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通过已知的吸光度，已知的消光系数，通过联立方程，可以得到样品中各组分的浓度。该方法要求药物在紫外/可见光区具有发色基团；抗体和药物在其紫外/可见光谱中表现出明显的最大吸收值；药物的存在不影响ADC样品中抗体部分的光吸收特性，同样抗体亦不影响药物的光吸收特性。由于含色氨酸或络氨酸残基的蛋白质通常在280nm处观察到最大吸收，因此要求细胞毒性药物在显著不同于280nm出表现出最大吸收。例如，毒素在252nm处有最大吸收，抗体在280nm处有最大吸收。但是连接子在252nm和280nm处不能有显著吸收，满足以上条件的话可以将ADC看作双组份混合物，利用比尔-朗伯定律来分别测定抗体和药物的浓度，随后可以计算出平均DAR值(摩尔浓度之比)。当然，如果连接子在上述的252nm和280nm有吸收，但与抗体和药物相比有不同的最大吸收，那么可以将ADC样品作为三组分体系，从而定量测定DAR值。所以利用紫外/可见分光光度法测定平均DAR值，需要考虑药物、连接子、抗体的影响。

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a.毒素DM1的UV谱图，b.曲妥珠单抗的UV谱图，c.曲妥珠ADC的UV谱图利用紫外可见分光光度法测定ADC的平均DAR值的具有实施步骤如下（对于抗体、药物双组分体系）：测定药物的最大吸收波长λ(D)测定药物最大吸收波长，一般而言毒素具有疏水性，通常使用有机溶剂（如二甲基乙酰胺、甲醇）来溶解，适宜的浓度，不可平头。抗体的最大吸收波长一般选择280nm即可；分别测定抗体和药物在280nm和最大吸收λ(D)处的消光系数(ε)通过抗体和药物已知的浓度（建议样品纯度要高），通过比尔-朗伯定律，分别测定抗体和药物在两个波长下的消光系数；测定ADC样品在280nm和最大吸收λ(D)处的吸光度ADC的平均DAR值计算通过上述第2步，已经确定了抗体和毒素在两个波长下的消光系数：

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       通过上述第3步，测定了ADC在280nm和λ(D)处的吸光值，利用比尔-朗伯定律，联立两个吸光度方程，如下：

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通过上述两个方程可以分别得到抗体和药物的浓度。

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ADC的DAR值计算结果如下：

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备注：c为摩尔浓度综上简而言之就是测定抗体和药物在两个波长下的消光系数，然后联立ADC在两个波长下的吸光度方程，解二元二次方程。UV分析DAR值注意事项利用紫外可见分光光度法测定ADC的平均DAR值方法虽然简单，且对实验室设备条件要求不高，但是在整个操作过程中还是有很多的影响因素，导致测定结果出现较大的误差。1、使用石英比色皿，不建议使用一次性比色皿，由于一次性比色皿多为塑料材质，有限的波长范围可能不适用于某些ADC，另外保持比色皿干净。2、抗体或者药物在不同的体系中可能会有不同的消光系数，应引起重视。3、样品的澄清度也很重要，如果浑浊会有较大干扰，同时样品需要有合适的浓度，即合理的吸光度范围。4、游离毒素（小分子）的影响也要注意。5、对于高DAR值或者偶联多个小分子的ADC要具体情况要具体分析。二.反相高效液相色谱法（RP法）对于半胱氨酸连接的偶联物，可以通过RP-HPLC测定每个偶联重链和轻链药物的加权峰面积百分比来计算平均DAR。该方法是根据待测物质极性的大小进行分离，用该方法得到的DAR与基于药物和抗体紫外吸收的分光光度法有良好的相关性。通过计算各轻、重链的峰面积百分比，结合每个峰偶联小分子药物的个数，计算加权平均DAR值，计算方程如下：平均偶联率计算公式：DAR=2× (ΣLC Weighted peak area+ΣHC Weighted peak area)/100。

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RP分析DAR值注意事项1、保证样品处于还原状态，对于没有CROSS的样品，保证只有L和H组分。2、保证每个组分有效分离，特别对于疏水性差异不大的组分。3、需要用RP-MS对每个峰进行鉴定，因为仅仅靠保留时间是无法确定每个峰的组分，对于某些ADC，重链的极性可能比偶联一个小分子的轻链大而先被洗脱下来。三.疏水作用色谱法（HIC）疏水相互作用色谱 (HIC) 是一种蛋白质分离、纯化和表征的传统技术。随着抗体偶联药物 (ADC) 的不断发展，HIC 在ADC 表征和分析上应用越来越广泛。与其他技术不同，HIC 允许蛋白质在保持天然结构和活性的温和非变性条件下进行分析。HIC的方法最早由Tiselius提出，他称此技术为'蛋白质盐析'。然而，实际的 HIC 术语后来由 Hjerten 创造，他描述此过程为在固体基质上，蛋白质的结合和洗脱蛋分离过程。疏水作用色谱固定相的非极性比较弱，流动相多采用高浓度盐缓冲液进行梯度洗脱。温和的分离条件，可以避免反相色谱中由于固定相较强的疏水性和有机流动相引起蛋白质的不可逆吸附和变性，因此特别适用于活性物质的分离与纯化。疏水作用色谱的固定相表面为弱疏水性基团，它的疏水性比反相色谱用的固定相低几十到几百倍，而流动相为高离子浓度的盐溶液。蛋白质分子在这样的固定相和流动相中进行分配，蛋白质分子上的疏水性基团和固定相的疏水基团作用而被保留。当用流动相洗脱时逐渐降低流动相的离子强度，洗脱能力增强。利用被分离组分分子表面的疏水微区、（可逆）变性后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开。蛋白质分子按其疏水性大小被依次洗脱出来，疏水性小的先流出。在这样的高盐水溶液中，蛋白质不会失活。高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。这种疏水作用的大小取决于固定相和溶质的极性、流动相的组成和浓度。由于各种蛋白质表面氨基酸残基极性不同，因此有可能通过改变固定相的极性和流动相的组成使蛋白质得到分离。

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图1.HIC原理示意图ADC 细胞毒剂（有效载荷）必须穿过脂质膜以抑制 DNA 复制、蛋白质合成、酶促活动或细胞分裂。要穿过膜，有效载荷必须是亲油的，因此在性质上是疏水的。有效载荷与抗体的连接增加了疏水性，这种变化可以通过 HIC 检测。载荷的数量与疏水性和滞留时间成正比。而且，疏水载荷越多，保留时间越长。通过疏水性差异分离各药物种类，并对各种类进行定量分析，是HIC分析ADC的基础。HIC可以和RP、MS等联用来分析ADC偶联情况。HIC必须与MS联用才能确认药物与抗体偶联比（DAR），因为峰值保留时间的变化不会直接显示药物偶联的程度，具体的峰鉴定则需要对HIC图谱中的各峰进行收集，通过测定各组分峰的分子量来确定。如果每个峰的偶联情况确定了，HIC可以很快并准确确定每种药物的比率。因此，HIC用于质量评价和反应监测的主要方法，由于分离过程的温和性，可以用于分析具有酸不稳定连接的ADC。使用Tris-HCl为基础的缓冲液以线性梯度从色谱柱中洗脱蛋白质，有利于不同疏水物质的分离。DAR是通过比较每个峰值的相对量和载荷的共轭程度来确定的（通过峰面积百分比和偶联药物个数计算加权平均DAR）。与用于ADC分析和表征的其他技术相比，HIC提供了一种独特、快速的分析方法，具有几个优点。如质谱、反相和亲水性相互作用色谱(HILIC)依赖有机溶剂作为流动相，低或高pH值，高温等，都有可能使ADC变性。而且针对ADC来优化这些方法从而解决这些问题又是非常耗时的。HIC分离得到的ADC组分保持活性，可用于疗效研究。HIC不能应用于一些亲水载荷。而且，非常疏水的有效载荷可能需要大量的方法开发。对于ADC的疏水性排序，HIC分析是最合适的，因为柱结合是由蛋白质的疏水性驱动的，而疏水性与保留时间成正比。HIC方法的优化没有通用的规则，针对不同的样品有不同的方法。本文所描述的方法利用常用的硫酸铵缓冲体系和丁基柱对ADC进行表征、排序和分析，是开发优化HIC方法基础。通过色谱峰面积百分比和偶联药物个数计算加权平均DAR值，计算公式：平均偶联率计算公式：DAR=Σ(Weighted peak area)/100

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HIC分析DAR值注意事项1.注意硫酸铵的储存及使用有效期，一般室温密闭条件下可以保存1个月。用时用0.2um滤膜过滤，注意观察是否有结晶析出。2.有效载荷在本质上是疏水性的。疏水性越强，保持时间越长。非常疏水的有效载荷可能会影响ADC峰的形状和洗脱，可能需要有机修饰剂来实现完全柱洗脱。对于疏水性非常强的载荷，当优化HIC方法时，应考虑非支链和较短侧链的色谱柱。3.提高流动相缓冲液的pH值有助于提高抗体和ADC的柱结合，而降低pH有助于蛋白质的洗脱。大多数抗体的等电点在7和9之间。因此，当缓冲液的pH值接近pI时，会减少净表面电荷，并可能促进与柱的相互作用。相反，降低缓冲液的pH值，远离pI，将增加净表面电荷，可能有助于蛋白质洗脱。然而，缓冲液pH值的变化对ADC结合和洗脱的影响是不可预测的，取决于树脂类型、缓冲盐和样品。4.不与HIC柱结合的样品会流穿，与溶剂峰一起洗脱，导致溶剂峰强度增加。将硫酸铵浓度提高到2 M，并将pH值调整到更接近ADC pI的位置是改善结合的策略。然而，对于某些adc来说，色谱柱可能就需要具有更长的链或更多非极性基团。5.HIC一般不会出现回收率差的问题。ADC没有注入到HIC色谱柱经常会被误解为没有从色谱柱洗脱，而实际上是由于ADC从一开始就没有进入到色谱柱上。因此，重要的是要验证ADC是否吸附在色谱柱，以及仪器是否正常工作。同时，确保溶剂峰值强度不升高。当ADC不能洗脱时，可在流动相B中加入有机改进剂，如异丙醇或乙腈（15%，v/v），以促进ADC从柱基质中释放，然而，应避免蛋白盐析或者变性。在流动相aA中不应使用有机修饰剂。这些修饰剂通过直接竞争与色谱柱的结合，并通过增加流动相的表面张力来帮助洗脱蛋白，从而减少疏水相互作用。因此，向流动A中添加修饰剂会增加蛋白不与色谱柱结合的可能性。如果使用其他色谱柱，首先确保未偶联的抗体结合并在梯度25%以前被洗脱。6.经典共轭ADC的一般方法通常无法实现峰基线分离;而对于更均匀的位点特异性共轭ADC，则得到了较好的结果，分别见图3和图4。为了达到良好的峰分离，需要对方法进行优化。优化需要考虑流速、梯度、HIC柱和流动相组成。由于分子的复杂性，优化HIC方法通常与未偶联ADC有一定差异。7.峰的分离是数据分析中需要检查的另一个重要参数。预期峰的数量应该反映在图谱中。缺少峰值或增加峰值对DAR计算都是有影响的。因此，质谱分析需要突出偶联药物的数量和每个峰的载药量，以确定峰分离方法的充分性。当考虑到这一点时，可以通过延长梯度来改善峰分离。8.梯度优化可以改善峰的形状和峰的分离，以提高数据的准确性。一般来说，增加梯度的长度可以改善峰的分离和形状。由于ADC的复杂性，梯度优化参数必须通过实验确定。梯度选择依赖于流动相、流速和色谱柱。使用硫酸铵缓冲液的洗脱梯度较短，但使用其他缓冲盐时必须延长梯度。9.丁基树脂是HIC柱最广泛使用的树脂，由于树脂链长，具有中等的结合倾向。典型的HIC柱具有线性的烷烃链或简单的芳香基团，并可以通过分支进一步修饰。不同厂家的丁基色谱柱可能会有不同的差异，从而影响结合、峰分离和洗脱。使用具有更长或更多支链的色谱柱可以增强样品的结合和保留。树脂的结合能力取决于链的长度，链越短，结合能力越弱，反之亦然。一些常见的树脂，按链长从低到高和结合能力的顺序为:甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基。10.样品纯度是HIC分析成功的关键。所有样本都应过滤，去除游离载荷和聚合，以确保获得准确的数据。对于小规模的偶联物，ADC可以使用缓冲交换柱进行纯化;对于大规模的制剂，ADC可以使用陶粒羟基磷灰石色谱或切向流过滤进行纯化，以去除或最小化自由载荷污染物和聚集物。自由载荷，特别是那些非常疏水的载荷，也会与HIC柱结合，这可能会使数据解释复杂化(如图6所示)。蛋白质聚集物往往更疏水，并将与单体分离，从而形成单独的峰。由于峰的识别对于准确的数据解释至关重要，所以应该尽一切努力消除由于聚集物和游离药物等人为因素造成的峰。11.进样体积请勿超过100 μL，否则ADC可能无法与柱结合。该方法旨在最小化样品制备。如果进样体积大，则样品缓冲界面的盐浓度过低，导致ADC不会被柱吸附。为了克服这个问题，可以在样品中加入体积比不超过50%的流动相A。同时要避免流动相A直接加入到样品中可能引起蛋白沉淀。12.注意溶剂峰的保留时间，如果保留时间有漂移，可能是盐的沉积堵塞管路，需清洗设备。记录柱安装后的初始仪表背压。背压的增加会影响结果。在样品运行前后，用50毫升水冲洗HPLC，清除仪器上的残留盐，以防止堵塞或限制流动。铵盐可能在仪器内沉淀，导致样品结合和回收率差、保留时间偏移、样品洗脱不完全，影响方法优化、数据解释和故障排除。13.柱温对样品的吸附和洗脱影响很小，但会影响峰型。柱温最好不要超过30℃，否则会使蛋白变性。柱温优化应该放在最后。14.在A280nm处监测洗脱峰时，硫酸铵缓冲液通过梯度洗脱会导致基线轻微偏移。然而，可以使用使信号与噪声之比最大化的任何吸收波长。在某些情况下，附加有效载荷后，可以在一个特有的波长下区分共轭峰与非共轭峰。例如，在330 nm下对吡咯苯并二氮杂卓偶联ADC进行检测，只能检测到偶联的峰。15.峰的积分是DAR计算的必要条件，良好的峰形对计算精度有重要意义。峰值形状主要受色谱柱和梯度的影响。如果峰太宽或太窄，峰的准确积分会受到影响。延长梯度可以改善窄峰的形状，缩短梯度有助于宽峰的形状。只有为了保证积分精度，才能改变峰的形状。改变流动相组成，例如，使用乙酸铵缓冲液或不同的色谱柱，可能会改善峰型。16.具有非疏水或亲水载荷的adc可能不具有典型的洗脱峰。这些ADC能以较短的保留时间洗脱或与裸抗共洗脱，如果ADC和未偶联抗体保留时间相同，则不能使用HIC进行分析和表征。17.共轭位点影响峰的形状和洗脱峰的数量。迄今为止，所有已批准的ADC均使用赖氨酸或铰链半胱氨酸的随机偶联方法。这种偶联方法产生多个峰，对应于药物负载的程度，分析起来可能很复杂(图2)。另外，临床试验中的几个ADC是位点特异性偶联到一个或多个工程位点。这些位点特异性ADC一般都是均匀的，用HIC分析时产生一个单峰，比随机共轭的adc疏水性更低。与随机偶联的ADC相比，一些位点特异性的偶联位点可以最大限度地减少负载的暴露，从而减少疏水性和保留时间。18.记录初始溶剂峰值强度。溶剂峰强度的增加表明样品结合不完全。溶剂峰强度对排除ADC结合问题非常有用。在方法优化过程中，当测试柱或流动相时，跟踪溶剂峰值强度是非常有用的。19.在对抗体和ADC进行疏水性排序时，应具有合适大的样品浓度和缓冲液。由于疏水性和脱靶毒性之间的联系，基于疏水性的药物候选排序是重要的。图7显示了针对相同肿瘤特异性抗原的6个抗体的HIC分析，这些抗体是ADC候选药物。在这种情况下，mAb-A疏水性最小。在对ADC进行疏水性排名分析时，抗体、偶联位点、偶联方法和负载都会影响保留时间。四.液质联用法（LC-MS ）非变性质谱分析已经证明了其用于抗体-药物偶联物(ADC)的定量和定性分析的强大优势，特别是当ADC亚基涉及非共价相互作用时(例如：半胱氨酸偶联ADC)。非变性质谱的应用广泛，如抗体-药物偶联物（Antibody-drug conjugates, ADCs）中药物的药物抗体比率（drug to antibody ratio, DAR）测定：ADCs药物根据抗体偶联的位点分为赖氨酸和半胱氨酸偶联的ADCs两类药物，对于赖氨酸偶联药物，测定常基于传统RPLC/MS技术平台，蛋白质需要在变性的条件下进行DAR测定，但是这种变性的条件会造成半胱氨酸偶联的ADCs抗体轻重链分离，因此，半胱氨酸偶联的ADCs检测可以借助非变性质谱的手段。液质联用法通过分子量大小进行分析，通过偶联不同数目小分子药物质量数的增加辨认出偶联不同数量小分子药物的抗体的峰，通过各峰面积百分比和偶联药物个数计算加权平均DAR值，计算公式：DAR=加权峰面积之和/100。液质联用不仅可以计算DAR值，还能够给出连接不同数量小分子药物的分布信息，以及反应过程副产物空linker的分布等情况。

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五.其他方法抗体偶联药物DAR值测定还有一些其他方法，比如：亲水作用色谱法（HILIC）、Cathepsin B酶切法等。亲水作用色谱法（HILIC）该方法是根据待测物质亲水性的不同进行分离，是抗体N-糖糖谱测定最常用的方法。HILIC分析ADC的DAR值前处理同反相高效液相色谱法，ADC采用IdeS酶切后还原，得到Fc/2、轻链L0，偶联一个小分子药物的轻链L1、Fd、偶联1-3个小分子药物的Fd1-Fd3，采用亲水作用色谱法进行分析。

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通过计算各峰面积百分比，结合每个峰偶联小分子药物的个数，计算加权平均DAR值，计算公式如下：平均偶联率计算公式：DAR=2× (ΣLC Weighted peak area+ΣFd Weighted peak area)/100。亲水作用色谱法不仅能对ADC的DAR值和药物分布情况进行分析，同时还能分析N-糖的分布情况，各峰的鉴定归属推荐先用LC-MS进行峰鉴定。该方法与反相高效液相色谱法相互印证。Cathepsin B酶切法（Cathepsin B）Cathepsin B是溶酶体内半胱氨酸蛋白水解酶，其催化作用由Cys、His 实现，易被巯基试剂抑制，又称巯基酶，属于木瓜蛋白酶家族。Cathepsin B酶切法首先将ADC用IdeS酶在铰链区下方切开，然后还原，使小分子药物充分暴露。这种预处理可以让Cathepsin B不受限制地进入裂解位点，确保充分酶切。通过反相高效液相色谱将裂解后的药物从蛋白组分中分离出来，并根据紫外吸收测定其浓度。

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以上就是抗体偶联药物DAR值测定常用的方法，还有一些不常用的方法，比如有用CE测DAR值的等等。随着分析技术的发展，DAR值测定的方法也会不断更新，但是根本点只有一个就是保证不同的组分可以有效分离，这样才能精确计算DAR值。对于上述ADC的DAR值测定方法，每个方法都不是孤立的，应该用多种方法去分析DAR值，不同方法相互佐证，才能对DAR值分析有更深的理解和得到更加准确的结果。参考文献1.Oscar Hernandez-Alba ，Analysis of ADCs by Native Mass Spectrometry ,197-211.2.Chen J, Yin S, Wu YJ, Ouyang J (2013) Development of a native nanoelectrospray mass spectrometry method for determination of the drug-to-antibody ratio of antibody-drug conjugates. Anal Chem 85(3):1699–1704 .3. Ryan Fleming（2020）ADC Analysis by Hydrophobic Interaction Chromatography.Methods Mol Biol 2078:147-1614. Cusumano A, Guillarme D, Beck A et al (2016) Practical method development for the separation of monoclonal antibodies and antibodydrug-conjugate species in hydrophobic interaction chromatography, part 2: optimization ofthe phase system. J Pharm Biomed Anal 121:161–1735. Fekete S, Veuthey JL, Beck A et al (2016)Hydrophobic interaction chromatography for the characterization of monoclonal antibodies and related products. J Pharm Biomed Anal 130:3–186. Alley SC, Anderson KE (2013) Analytical and bioanalytical technologies for characterizing antibody–drug conjugates. Curr Opin Chem Biol 17(3):406–4117.D'Atri V, Fekete S, Stoll D, et al. Characterization of an antibody-drug conjugate by hydrophilic interaction chromatography coupled to mass spectrometry. J Chromatogr B 2018, 1018: 37-41.8.Adamo M, Guoyong Sun GY, Qiu DF, et al. Drug-to-antibody determination for an antibody-drug-conjugate utilizing cathepsin B digestion coupled with reversed-phase high-pressure liquid chromatography analysis. J Chromatogr A, 2017, 1481: 44-52.公众号已建立ADC质量研究群，扫描下方小编二维码加入，入群请告知姓名、工作单位及职务。关于ADC质量研究的问题，大家可以随时私信小编，我们一起交流、学习、进步。↑ 小编微信 本站仅提供存储服务，所有内容均由用户发布，如发现有害或侵权内容，请点击举报。